Лекция "Вирусы"

Автор: Ягина Людмила Григорьевна

МОУ "СОШ № 3", г Красный Кут Саратовской области

 

Задачи: Рассмотреть особенности строения, жизнедеятельности вирусов и их значение в природе и для человека.

История вирусологии. 

Приоритет открытия вирусов принадлежит выдающемуся русскому ученому Д.И. Ивановскому.

Еще будучи студентом Петербургского университета, в 1887 г. по предложению своих учителей А.Н. Бекетова и А.С. Фаминцына Д.И. Ивановский вместе со студентом В.В. Половцевым приступил к изучению мозаичной болезни табака, наносившей большой вред сельскому хозяйству.

Ими было установлено, что описанная в Голландии А. Мейером мозаичная болезнь табака представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения, одно из которых — рябуха (ее возбудитель — грибок), а другое — собственно мозаичная болезнь табака неизвестного происхождения. Изучение природы этого заболевания Д.И. Ивановский проводил самостоятельно, оно и привело его к открытию первого вируса. Капелькой сока, взятого от больного растения, Д.И. Ивановский заражал здоровое растение и вызывал его заболевание. Это убедило его в том, что инфекционное начало находится в соке. Однако при микроскопии сока он не обнаружил в нем никаких бактерий, а посевы сока на питательные среды не давали никакого роста. Тогда Д.И. Ивановский решил профильтровать такой странный сок через фарфоровые фильтры, через которые бактерии не проходят. Однако профильтрованный сок вызывал мозаичную болезнь у здоровых растений спустя 15 дней после заражения. Еще более любопытным был тот факт, что профильтрованный сок, нагретый до 60-70°С, утрачивал инфекционные свойства. К тому же, при последовательном заражении соком больных растений болезнь проявлялась всегда, т. е. заразное начало не разбавлялось, а будучи введенным в растение, в нем размножалось, значит, являлось живым существом, которое Д.И. Ивановский назвал фильтрующимся вирусом. Результаты своих работ он опубликовал в журнале «Сельское хозяйство и лесоводство» в статье «О двух болезнях табака» и доложил на заседании Российской Академии наук.

12 февраля 1892 г. является официальным днем рождения новой науки — вирусологии, а Д.И. Ивановский — ее основоположником.

Очень скоро после работ Д.И. Ивановского было установлено, что вирусы широко распространены в природе и вызывают заболевания не только у растений, но и у животных и человека. Открытия вирусов следовали одно за другим: 1897 г. - вирус ящура; 1901 г. - вирус желтой лихорадки; 1903 г. — вирус бешенства; 1908 г. — вирус оспы человека; 1909 г. — вирус полиомиелита. Эти открытия не прекращаются и в наше время: 1970 г. - вирус гепатита В; 1973 г. - вирус гепатита А; 1977 г. - вирус дельта-гепатита; 1983 г. - вирус СПИДа.

Основные свойства вирусов.

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных живых существ следующие:

· ультрамикроскопические размеры;

· содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК, или РНК (все другие организмы содержат нуклеиновые кислоты обоих типов, а геном у них представлен только ДНК);

· вирусы не способны к росту и бинарному делению;

· вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты;

· у вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии;

· у вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

· вирусы – абсолютные внутриклеточные паразиты, их средой обитания являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

С учетом перечисленных особенностей вирусам можно дать следующее определение: Вирусы – это особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся, поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами (А.И. Коротяев).

Существует и другой взгляд на природу вирусов: «... вирусы можно рассматривать как генетические элементы, одетые в защитную оболочку и способные переходить из одной клетки в другую» (Б. Альберте с соавт., 1986).

Молекулярно-генетическая организация вирусов

Основой таксономии вирусов является вирион, который представляет собой конечную фазу развития вируса. Вирион состоит из геномной нуклеиновой кислоты, окруженной одной или двумя оболочками.По строению вирусы можно разделить на 4 типа, которые различаются по характеру упаковки морфологических субъединиц:

а) вирусы со спиральной симметрией;

б) изометрические вирусы с кубической симметрией;

в) вирусы с бинарной симметрией, например фаги: у них головка имеет кубический тип симметрии, а хвостик - спиральный;

г) более сложно организованные вирусы, имеющие вторую оболочку.

Оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота, называется капсидом (от греч. capsa - ящик). Наиболее просто организованные вирусы представляют собой нуклеокапсиды: они состоят только из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, построенной из идентичных пептидных молекул. Поскольку число аминокислотных остатков в белковой молекуле всегда меньше числа нуклеотидов в гене (код триплетный), то для того, чтобы упаковать геномную нуклеиновую кислот требуется большое число одинаковых белковых молекул. А многократное повторение белок-белковых взаимодействий возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Существует всего два способа упаковки одинаковых белковых молекул в капсид, при которых он обладал бы стабильностью. Процесс образования такого полимера родствен процессу кристаллизации, он протекает по типу самосборки. Один из вариантов такой самосборки происходит с использованием спиральной симметрии, другой - кубической симметрии.

При спиральной симметрии (ее имеют нитевидные вирусы) белковые субъединицы располагают по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота. Лучше все этот тип молекулярной организации вириона изучен у вируса мозаичной болезни табака, капсид вириона которого состоит из 2130 белковых молекул, винтообразно уложенных вокруг РНК, содержащей около 6000 нуклеотидов. С каждой белковой субъединицей связано три нуклеотида. Белковая спираль состоит из 130 витков. При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает геномную нуклеиновую кислоту, но при этом требуется большее количество белка, чем при кубической симметрии.

Большинство вирусов с замкнутым чехлом обладает кубической симметрией. В ее основе лежат различные комбинации равносторонних треугольников, образующихся из сочетания шаровидных белковых субъединиц. Сочетаясь определенным образом друг с другом, они могут формировать замкнутую сферическую поверхность. Из различных сочетаний равносторонних треугольников, которые образуют общую вершину и общую ось симметрии, могут возникать различные варианты многогранников: тетраэдры, октаэдры и икосаэдры. Икосаэдры имеют 20 граней (каждая представляет равносторонний треугольник), 12 вершин и пятикратную тройную и двойную оси вращательной симметрии. Это самая эффективная и экономичная симметрия для формирования замкнутого чехла, так как в этом случае при его сборке используются строительные белки минимального размера и обеспечивается наибольший внутренний объем вириона. Видимо, поэтому сферические вирусы животных чаще всего имеют форму икосаэдра.

Число капсомеров для вирусов данного вида является постоянным, оно имеет диагностическое значение. Например, вирион аденовирусов имеет 252 капсомера, у парвовирусов - 32, у паповавирусов - 72. Молекулярная организация всех простых вирусов сводится к использованию спиральной и кубической симметрии.

Более сложно устроены вирусы, у которых имеется вторая оболочка. Вначале она получила название «пеплоса» (накидка греческих солдат). Позднее ее стали называть суперкапсидом. Он представляет собой обычную биологическую мембрану, состоящую из двух слоев липидов, имеющих клеточное происхождение, и заключенных в них гликозилированных суперкапсидных вирусных белков, которые выступают над наружной поверхностью вириона в виде своеобразных шипов.

Суперкапсидные вирусные белки, образующие шипы, обладают жизненно важными для вируса функциями: они распознают клеточные рецепторы и связываются с ними; обеспечивают слияние вирусной мембраны с мембраной клетки и ее лизосом; способствуют распространению вируса организме за счет слияния клеток; многие из них обладают свойствами протективных антигенов т. д. Многие сложные вирусы, такие как ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и другие устроены таким образом, что их нуклеокапсид, имеющий палочковидную спиральную структуру, свернутую определенным образом, окружен суперкапсидной липопротеиновой оболочкой, придающей вириону сферическую форму.

Вирионы рабдовирусов содержат спиральный нуклеокапсид, образующий цилиндрическую структуру, покрытую липидсодержащим суперкапсидом, который придает вириону пулевидную форму. У других вирусов, например у тогавирусов, нуклеокапсид имеет форму икосаэдра, который окружен суперкапсидной оболочкой, придающей вириону шаровидную форму. Вирион ретровирусов имеет икосаэдрический капсид, внутри которого располагается спиральный нуклеокапсид, а сам вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, придающей ему сферическую форму.

Наиболее сложное строение имеют самые крупные вирусы, относящиеся к семейству поксвирусов. Их вирионы имеют форму параллелепипеда (или овоидную), размером 300-450 х 170-260 нм. Вирионы покрыты внешней оболочкой, под которой располагаются сложное образование из тубулярных структур и внутреннее ядро, состоящее из ДНК-содержащей сердцевины и одного или двух боковых телец. Вирион содержит более 30 структурных белков и несколько ферментов. Таким образом, структура вириона у каждого семейства вирусов имеет отличительные особенности. Форма и относительные размеры ДНК - и РНК - содержащих вирусов представлены на рисунках.

Вироиды и прионы

В природе помимо вирусов обнаружены другие очень мелкие загадочные инфекционные агенты с необычными свойствами. К ним относятся вироиды и прионы.

Вироиды. Название «вироид» было предложено в 1971г. Т. Динером. Оно свидетельствует о том, что симптомы заболеваний, которые вызывают эти агенты у различных растений, похожи на симптомы заболеваний, вызываемых у них вирусами. Однако вироиды отличаются от вирусов по крайней мере по следующим четырем признакам:

· Вироиды, в отличие от вирусов, не имеют белковой оболочки и состоят только из инфекционной молекулы РНК.

· Они не обладают антигенными свойствами и поэтому не могут быть обнаружены серологическими методами.

· Вироиды имеют очень малые размеры: длина молекулы РНК вироидов равна 1 • 106 мм, она состоит из 300-400 нуклеотидов.

· Вироиды - самые маленькие способные к размножению единицы, известные в природе.

· Молекулы вироидов представляют собой одноцепочечные кольцевые РНК.

· Молекулы РНК вироидов не кодируют собственных белков, поэтому их размножение может происходить либо аутокаталитически, либо оно зависит от клетки-хозяина.

С 1971 г. обнаружено более 10 различных вироидов, отличающихся по первичной структуре, кругу поражаемых хозяев, по симптомам вызываемых ими заболеваний. Все известные вироиды построены по одному плану: 300-400 нуклеотидов образуют кольцо, которое удерживается парами оснований и образует двухцепочечную палочковидную структуру с перемежающимися короткими одно- и двухцепочечными участками.

Вопрос о природе, происхождении вироидов и о том, каким способом они распространяются, остается открытым. Существует предположение, что вироиды образуются из нормальных клеточных РНК, однако убедительных подтверждений этому не было представлено.

Прионы. Еще более загадочную природу имеет группа особых инфекционных агентов белковой природы, получивших название прионов. Их считают возбудителями медленных летальных инфекций, характеризующихся поражением ЦНС человека и животных и объединенных в группу «подострых трансмиссивных губкообразных энцефалопатии». Она включает четыре болезни человека - куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, синдром Герстманна-Штрейслера, амиотрофический лейкоспонгиоз – и четыре болезни животных: скрепи овец, губкообразную энцефалопатию коров, трансмиссивную энцефалопатию норок и хроническую изнуряющую болезнь находящихся в неволе чернохвостого оленя и лосей.

Методы культивирования вирусов.

Возможности изучения вирусов возрастали по мере совершенствования методов их исследования. Как известно, Л. Пастер еще в 1884 г. для обнаружения вируса бешенства использовал метод заражения животных. Использование метода фильтрования через фарфоровые свечи позволило Д.И. Ивановскому открыть царство вирусов. С изобретением электронной микроскопии появилась возможность увидеть вирусы и изучать их морфологию. Совершенствование методов сверхскоростного центрифугирования в градиенте плотности позволило получить препараты вирусов в очищенном виде и установить их химический состав. Исключительно важное значение для развития вирусологии имела разработка методов культивирования вирусов. Раньше всего для этой цели было использовано заражение различных животных, но этот метод еще не позволял получать чистые культуры вирусов, с его помощью их можно было только обнаружить и установить причинную связь с той или иной болезнью.

Поскольку вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно, нужно было найти простые и общедоступные методы их культивирования. Крупным достижением было предложение в 1932 г. Р. Гудпасчура использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы, в клетках которых успешно размножаются многие вирусы. Однако окончательное решение проблемы их культивирования оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Хотя способность клеток расти вне организма была установлена еще в 1907 г., потребовалось много лет для разработки доступных методов культивирования клеток, а в них — вирусов. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут переживать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться. К началу второй половины XX века эпидемии полиомиелита приняли настолько широкий и опасный характер, что требовалось принять немедленные меры для создания вакцины, которую можно было бы использовать для массового применения. Но для этого нужно было найти метод, позволяющий быстро выращивать вирусы в большом количестве. Это и явилось одним из обстоятельств, стимулировавших разработку методов культивирования вирусов. Для получения культур клеток, которые можно было бы использовать для выращивания вирусов, необходимо было решить четыре главных проблемы:

· получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

· создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

· обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

· определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Все эти проблемы были решены. Для выделения изолированных, но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей использовали обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межклеточные мостики. Решающее значение имели опыты, проведенные в 1949 г. Дж. Эндерсом, Т. Веллером и Ф. Роббинсом, которые показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян.

Разработка способов получения культур клеток позволила широко внедрить в практическую медицину современные классические методы вирусологической диагностики инфекционных заболеваний, с одной стороны, и обеспечить накопление вирусов в количествах, достаточных для производства вакцин, с другой. Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток. Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в настоящее время используют чаще заражение куриных эмбрионов, первично-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток.

Широкое распространение получил предложенный в 1952г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов.

Методы идентификации (типирования) вирусов

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

· нейтрализация цитопатического действия;

· нейтрализация реакции гемадсорбции;

· изменение проявления цветной пробы;

· задержка (торможение) реакции гемагглютинации;

· нейтрализация в опытах на животных.

Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлуоресценции, а также ДНК- ДНК (РНК-РНК)-гибридизации.

Классификация вирусов

Для классификации вирусов в настоящее время используют следующие критерии:

· Нуклеиновая кислота: тип, число нитей, процентное содержание, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина.

· Морфология: тип симметрии или псевдосимметрии, число капсомеров для вирусов с кубической симметрией, наличие внешней липопротеиновой оболочки, форма, размеры вирионов.

· Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность.

· Белки: количество структурных белков, их локализация, аминокислотный состав.

· Липидный состав.

· Размножение в тканевых культурах, особенности репликации.

· Круг поражаемых хозяев, особенности патогенеза инфекционного процесса; онкогенные свойства.

·  Устойчивость к физическим и химическим факторам (гамма-лучи, термоинактивация при 37°С и 50°С, действие жирорастворителей и отдельных катионов).

· Антигенные свойства.

По этим критериям группируются все вирусы независимо от круга их носителей (вирусы позвоночных, беспозвоночных, растений

Под жизненным циклом вируса понимают процесс его размножения. Он происходит только внутриклеточно. Особенности размножения зависят прежде всего от вирусного генома.

Механизм взаимодействия вируса с клеткой

Жизненный цикл вирусов начинается с их адсорбции на мембране клетки-мишени и заканчивается выходом вновь синтезированных вирионов из клетки. Цикл включает в себя следующие стадии:

· Адсорбция.

· Внедрение вириона в клетку, сопряженное с одновременным разрушением его суперкапсидных и капсидных белков и высвобождением его геномной нуклеиновой кислоты.

· Внутриклеточное размножение вируса, включающее в себя целую серию последовательных событий, заканчивающихся формированием зрелых вирионов и выходом их из клетки.

У вирусов, геном которых представлен позитивной РНК, внутриклеточное размножение начинается с ее трансляции. К ней присоединяются процессы репликации, затем сборки нуклеокапсида. У всех остальных вирусов процесс внутриклеточного размножения начинается с транскрипции геномной нуклеиновой кислоты, затем происходит трансляция вирусных мРНК, репликация геномной нуклеиновой кислоты, формирование нуклеокапсида.

Если вирусы обладают суперкапсидом, его белки после синтеза на рибосомах, ассоциированных с мембранами, и гликозилирования устанавливаются на наружной поверхности клеточной мембраны в виде своеобразных шипов, вытесняя клеточные белки. В этом случае завершающим этапом морфогенеза вириона является прохождение нуклеокапсида через модифицированную клеточную мембрану с образованием суперкапсидной оболочки. Заключительным этапом внутриклеточного размножения является выход вновь синтезированных вирионов из клетки.

Адсорбция вируса на мембране клетки является пусковым моментом в реализации его патогенных свойств, ибо без этого вирус не может проникнуть в клетку и размножаться в ней, он просто обречен на гибель. Для каждого вируса на мембране клеток существуют специфические рецепторы, с которыми вирусы связываются с помощью своих рецепторов. В основе так называемой органотропности вирусов и лежит наличие как у клеток, так и у вирусов соответствующих рецепторов. В связи с разнообразием клеточных и вирусных рецепторов на одних и тех же клетках могут адсорбироваться разные вирусы. Например, рецепторами для вируса гриппа являются мукопептиды, содержащие свободную N-ацетилнейраминовую кислоту, а рецептором вирусов, распознающим его, является белок - гемагглютинин.

Проникновение вируса в клетку Известны два механизма проникновения вируса в клетку: посредством слияния суперкапсида вируса с мембраной клетки. Благодаря этому происходит высвобождение нуклеокапсида в цитоплазму с последующей реализацией свойств вирусного генома. Другой механизм получил название рецепторопосредованного эндоцитоза (пиноцитоза). В этом случае вирус связывается со специфическими рецепторами в области мембраны, окаймленной своеобразными  щетинками), которая затем впячивается внутрь клетки и  превращается в окаймленный  пузырек, содержащий поглощенный  вирион; быстро  сливается с  промежуточным  пузырьком,  называемым  эндосомой,  и с лизосомой. Благодаря особым свойствам вирусных суперкапсидных белков происходит слияние липидных слоев суперкапсида и мембраны лизосомы. В результате этого нуклеокапсид оказывается в цитозоле клетки, где происходит дальнейшее «раздевание» нуклеокапсида и высвобождение геномной нуклеиновой кислоты.

Внутриклеточное  размножение Проникнув в клетку, вирусный геном полностью подчиняет жизнь клетки своим интересам и с помощью ее белоксинтезирующей системы и систем генераций энергии осуществляет собственное воспроизводство, очень часто ценой жизни клетки. Освобожденная геномная РНК транслируется на рибосомах клетки-хозяина, в результате чего синтезируется вирус-специфическая РНК-полимераза (репликаза), которая осуществляет многократную репликацию в РНК. В свою очередь молекула родительской вРНК и вновь синтезированные ее копии служат в качестве матриц, направляющих синтез основных структурных белков вируса.

Синтез капсидного белка осуществляют свободные полирибосомы цитозоля, вновь синтезированный капсидный белок ассоциирует с реплицированными копиями вРНК, в результате чего формируются нуклеокапсиды. Суперкапсидные белки синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, включаются в мембрану и там гликозилируются, а затем переносятся в мембрану аппарата Гольджи, где они подвергаются дополнительному гликозилированию, после чего поступают на наружную поверхность клеточной мембраны, вытесняя здесь клеточные белки. Заключительный этап морфогенеза вируса заключается в том, что нуклеокапсид, проходя через клеточную мембрану, обволакивается участком мембраны и встроенными в нее в этом месте вирусспецифическими суперкапсидными белками, после чего отпочковывается от клетки, отделяясь от ее поверхности так, что оказывается окруженным замкнутой внешней оболочкой (суперкапсидом).

Литература:

1. С. Лурия, Дж. Дарнелл. Общая вирусология. М., 1970.

2. А.Г. Букринская. Вирусология. М., 1986.

3. А.И .Коротяев, С.А .Бабичев. Мед. микробиол., иммунол. и вирусология. СПб.,1998. 2000, 2001.